-   Aile bağlantı çalışmaları

-  Gen dozaj yöntemi

-   In situ hibridizasyon yöntemi

-   İnterspesifik somatik hücre hibridizasyonu

-   Kromozom ayırımı yöntemi

-    Aile bağlantı çalışmaları :

 

Aile bağlantı çalışmalarında biri marker ya da simge olarak kullanılan diğeri de söz konusu hastalık ya da özellik için kullanılan iki lokus ele alınmaktadır.Bu tür çalışmalarda kişilerin hasta olup olmadıklarını ortaya koymak ve marker yada simge özelliğine göre durumlarını saptamak üzere tüm aile bireyleri incelenir.

Eğer hastalık ve marker lokusları farklı kromozomlardaysa , bağımsız düzenlenme gerçekleşecek ve hastalık ile marker genleri gametlere ve dolayısıyla çocuklara birlikte gittikleri kadar ayrı ayrı da gideceklerdir.Buna karşı eğer hastalık ve marker lokusları aynı kromozom üzerinde birbirine yakın bulunuyorsa , bu durumda bağımsız düzenlenme gerçekleşmeyecektir . Böylece hastalık ve marker genleri , bir şans sonucu mayoz bölünme sırasında krossing-overle birbirinden ayrılmadıkları sürece her çocukta birlikte görülürler . Örneğin erkekte ortalama olarak 52 krossing-over oluşur ve her kromozomdaki krossing-over sayısı kromozomun uzunluğuna bağlı olmak üzere 1-6 arasında değişmektedir.Eğer aynı kromozom üzerindeki hastalık ve marker lokusları birbirinden yeterince uzakta bulunuyorsa , o zaman bunlar arasında krossing-over oluşur ve rekombinant bireylerde iki lokus birbirinden ayrılarak yer alırken non-rekombinant yada atasal bireylerde ikisi birlikte bulunur.

İki lokus arasındaki böyle bir uzaklıktan dolayı marker özellik gösteren rekombinant bireylerin sayısı ile yine marker özellik gösteren atasal bireylerin sayısı birbirine eşit,yani rekombinant bireylerin oranı %50 olacak ve bu durum bağımsız düzenlenme ,ilkesini taklit eder şekilde kendisini gösterecektir.

Aile bağlantı çalışmalarında kullanılan polimorfik marker özellikler:

protein varyantları

DNA varyantları

Halbuki hastalık ve marker lokusları arasındaki uzaklık azalırsa , krossing-over şansıda buna bağlı olarak düşecek, rekombinant bireylerin sayısı azalacak, rekombinasyon fraksiyonu küçülecek ve bağımsız düzenlenmedeki karışıklıkta artacaktır.Bundan dolayı rekombinasyon fraksiyonu % 0 (iki lokus birbirine bitişik) ile % 50 (bağımsız düzenlenmeye eşdeğer) arasında değişecektir.

-    Gen Dozaj Yöntemi :

 

Otozomal genler , çiftler halinde bulunurlar ve normal olarak bunların her ikisi de fenotipte ifadesini bulur.Örneğin bir enzimin oluşmasını sağlayan iki normal allel varsa o zaman bu enzimin aktivitesi % 100 olacaktır.Böyle olunca dengesiz otozomal kromozom düzensizlikleri , bu kromozom üzerinde taşınan genler hakkında dozaj çalışmaları yapıldığı zaman bilgi verici önemli bir kaynak oluşturmaktadır . Eğer enzim lokusunu taşıyan parça otozomal kromozom eşlerinden birinde delesyona uğrayacak olursa enzim aktivitesi yarı yarıya azalacak ve bu durum geriye kalan normal allelin aktivitesini gösterecektir.Tersine eğer kişi enzim lokusunu taşıyan kromozom kesimi için trizomikse , bu kez enzim düzeyi % 150 olacaktır.Farklı kırılma noktalarına göre ortaya çıkan bir grup kromozom düzensizliklerindeki enzim düzeylerini karşılaştırarak ilgili genin lokalizasyonu saptanabilmektedir.Bu teknik ilk kez asit fosfataz geninin (ACP1) , 2 numaralı kromozomun kısa koluna yerleştiğini doğrulamak üzere kullanılmıştır . Bu doğrulama çalışmalarında elde edilen veriler, 2 numaralı kromozom delesyonu bulunan bir çocuğun annesinden asit fosfataz allelini alamamış olduğunu düşündürmüştür.

-    İn stu hibridizasyon :

İn stu hibridizasyon yönteminin ana ilkesi ; belirli bir DNA segmenti kullanmak suretiyle , bu segmentin kromozom takımı içindeki komplementeri olan segmenti bulmaktır.Bilinen bu DNA segmenti radyoizotopik ya da non-izotopik olarak işaretlenir ,ısıtılıp çabucak soğutularak tek dallı hale getirilir.Bundan sonra standart tekniğe göre hazırlanmış , denatüre edilmiş ve havada kurutulmuş olan kromozom preparatlarına uygulanır.Daha sonra hazırlanan prob , kromozom üzerindeki kendinin komplementeri olan segment ile birleşir ve bu durum mikroskop ile gösterilir. Bu teknik ilk kez immünoglobulin kappa hafif zincir geninin 2 numaralı kromozomun kısa koluna haritalanması işleminde kullanılmıştır.Bugün ise sonuçları 1-2 gün içerisinde alınan non-izotopik prob işaretlemedeki ilerlemeler sonucunda özellikle klonlanmış DNA dizilerinin haritalanmasında standart teknik durumuna gelmiştir.

Aslında radyoizotopla işaretlenmiş problar da bu amaç için kullanılmaktadır ,fakat bu yöntemle sonuç alma süresi 4 hafta kadar sürmekte ve dolayısıyla non-izotopik problar tercih edilmektedir. Non-izotopik işaretleme işlemi , biyotinin (ya da benzerleri) DNA probu içerisine enkorporasyonu esasına dayanmaktadır.İşlemdeki hibridizasyonun durumu ,bir floresans boyaya bağlanmış anti-biyotin (yada streptavidin) molekülü kullanılarak ortaya konur ve bu bir floresans mikroskop yardımı ile incelenebilir.Her biri farklı floresans boya veren birkaç işaret kullanmak suretiyle birkaç probu (her biri 5 kilo bazdan daha büyük) aynı anda incelemek mümkündür.Ancak kromozomlar üzerindeki hibridize olan dizilerin birbirine uzaklığı en az1 Mb kadar olmalıdır aksi takdirde bu çok renkli yöntem başarısızlıkla sonuçlanabilir.Fakat interfaz nükleuslarındaki uzun kromozomlar kullanılmak suretiyle probların rezolüsyonları 50-100 kb kadar küçültülebilmektedir.

-    İnterspesifik Somatik Hücre Hibridizasyonu :

Bir somatik hücre hibridi , Sendai virüsü gibi inaktive edilen veya bazı kimyasal ajanların bulunup bulunmamasına göre hazırlanan hücre kültürlerinde iki somatik hücrenin birleştirilmesiyle oluşturulur.Gen haritalamasında somatik hücrelerden birisi insan orijinli diğeri de başka bir tür,fare orijinli seçilir.Başlangıçta bu hibrid hücre biri insan biri de fare olmak üzere iki kromozom takımını birlikte bulunduracaktır.İnsan kromozomları önce selektif olarak,fakat rasgele ve hızla kaybolmaya başlar ve bu devam eder.Fare ve insan kromozomları hem farklı morfolojileri hem de Giemsa ile farklı boyanmaları sayesinde birbirlerinden kolayca ayırt edilebilirler . Zira alkali ortamda Giemsa ile fare kromozomları parlak mor renge boyanırken, geriye kalan insan kromozomları soluk mavi renge boyanır.Eğer hibrid hücredeki fare hücresi timidinkinaz eksikliği için homozigot olduğu halde hibrid hücrede timidin kinaz (TK) aktivitesi görülecek olursa , hibrid hücredeki insan kromozomunun bu enzimi oluşturduğu anlaşılmış olacaktır.Bu şekilde hibrid hücrelerin seleksiyonu ile timidin kinaz aktivitesinin ancak insan 17 nolu kromozomun bulunduğu zaman görüldüğü ve bu genin 17 numaralı kromozoma yerleşmiş olduğu doğrulanmıştır.Timidin kinaz lokusunun 17 numaralı kromozoma yerleştirilmesi,somatik hücre hibridizasyonuyla yapılan ilk gen haritalaması işlemidir.

 

-    Kromozom ayırımı ( kromozom sorting ) yöntemi :

 

Floresanslandırılmış kromozom ayırımı yöntemi , bir yada daha fazla floresans veren DNA boyaları ile boyanan kromozomların , aldıkları boya yoğunluğuna göre FACS (Floresanslandırılmış hücre ayırıcı ) adı verilen bir aletle teker teker ayrıştırılması ve saflaştırılması esasına dayanır. Bu alet yalnızca metafaz kromozomlarının flow karyotiplerini yapmakla kalmaz , aynı zamanda kromozom yada kromozom gruplarını ayrı ayrı tüplerde de toplayabilir. Bu şekilde ayrılmış olan kromozomlar bundan sonra kromozom-spesifik genomik DNA kitaplığı oluşturulmasında ya da gen haritalamasında kullanılabilir. FACS ile belirli bir DNA dizisinin haritalanması , her kromozom çiftinin bir nitroselluloz filtre üzerine ayrılması için yaklaşık 1000 kromozomun ayrımının yapılmasıyla çok kolay bir şekilde başarılmaktadır.

Bu nitroselluloz filtreler denatüre edildikten sonra , öğrenilmek istenen radyoaktif işaretli probla tüm filtre seti hibridize edilir.Bundan sonra otoradyografi yapılır ve probun kromozom lokalizasyonu sağlanır.Bu işlem bir kez yapıldıktan sonra ayrımı yapılmış translokasyonlardan yararlanarak dot blot analizi ile bu kez probun kromozom bölgelerine göre lokalizasyonları yapılabilir.

Akademikkemal

Kaynak: